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  一、细胞组学的概念:

  随着人类基因组计划的完成,基因组学、蛋白质组学已经为大家所熟悉。20世纪末,药理毒理学家又提出了代谢组学的概念。生命体内的许多终端效应分子并不都是核酸和蛋白质,许多非核酸非蛋白质类的中间及终末代谢产物在执行着重要的生理生化功能。代谢组学就是以研究细胞内一整套代谢产物为目的的学科。细胞组学(cytomics)涵盖了细胞中的一切事件,是细胞基因组、蛋白质组、代谢组及细胞行为网络的总体概括。经典的细胞生物学着重研究细胞的形态、亚细胞结构及细胞器的功能,而细胞组学还强调细胞的整体行为及内环境和外环境对细胞行为的影响。

  

细胞组学图1


  细胞组可以被定义为人体的细胞系统以及亚细胞系统和功能组分。

  细胞组学是对于细胞组差异性进行研究的学科,更确切地说,细胞组学是基于基因型差异并综合全面的生物信息学知识而概括出的单细胞分子表型的学科。不同表型细胞功能的调节是一个具有高度动态性、空间性和时间性细微差异的过程。

  细胞组学(cytomics)属于系统生物学的范畴,但与基因组学、转录组学、蛋白组学和代谢物组学相比,同时兼有在单细胞水平独有的“一组学”和功能相结合的特征,是连接基因组、蛋白组和组织功能的桥梁。细胞组学是近年来发展起来的一种致力于确定单细胞分子表型,进而研究细胞结构及分子功能的科学。其本质是使用高灵敏多参数荧光分析方法整合多种单细胞的不同事件,阐释组织和有机体的复杂事件和行为。

  基因组定义了一个生物体的遗传潜力,但是不能完全反映环境变化时细胞整体功能性的变化,而细胞是机体表现功能的基本单位,其功能紊乱直接导致疾病的产生,因此,细胞不同的分子表型(疾病或受疾病影响的细胞分子表型)即细胞组学成为探索疾病分子机制行之有效的策略。

  从认识生命的理论角度看,某一物种只有一套基因组,而这套基因组编码着一套蛋白质组,在细胞的不同状态或机体内不同的细胞组,一定不是全套基因组编码的整套蛋白质组在起作用,而只是特定的基因编码的一系列蛋白质决定着细胞的不同状态或功能,随着细胞状态或功能的转变,其存在的分子基础也必将改变,这将是cytomics的主要研究对象与内容。

  从研究生命的技术角度看,多细胞生物体内有许多具有不同状态(不同生命活动状态或功能状态)的细胞群体,形成了生物体细胞层面的异质性,尽管它们都具备同一套基因组或理论上的蛋白质组,但在不同的细胞群体中构成其表型的实际蛋白质组却大不一样,这种具有同一实际蛋白质组和同样细胞表型的细胞群体被认为是“细胞组”(cytome);只有从多个细胞组(cytome)并存的细胞异质群体中,将特定的细胞组分离出来,作进一步的生化分析,才能从浩瀚的全套基因组和蛋白质组数据中,解读出决定细胞身份和命令细胞行为的密码。

  二、细胞组学的特点:

  不同于传统的生物分析技术,细胞组学具有其独特之处,而这也是这门新科学的优势所在。归纳其特点有以下 3 个方面:

  1、细胞组学是在单细胞水平上进行分析,反映了细胞的真实情况,避免因组织或细胞体系不同细胞间存在异质性而造成研究结果的偏差。。

  2、细胞组学的思路与传统的研究不同,传统的研究策略主要立足于对各个基因功能的研究,然后再考察它们在细胞中的作用以及相互联系,而细胞组学则集中于细胞中分子表型的分析。细胞表型是基因和环境因素共同作用的结果,这样可以先不用对具体的分子机制做过多、过细的研究,而是用整体的思想来寻找特异的分子作用靶点,然后再分析这些分子的具体功能及作用模型。这一研究策略很好地应用了人类基因组的信息库,代表了一种更为高效和简单的策略。

  3、细胞组学是在单细胞水平上蛋白质组和基因组研究的结合。

  三、细胞组学的历史发展:

  众所周知,人类基因组计划(HumanGenome Project,HGP)的实施,带动了许多相关领域的发展,使得病毒、细菌、酵母、植物、动物、乃至人类的基因组得以阐明,由此产生了基因组学。该学科通过相应的核酸分析技术,明确了物种的全套基因组及其序列。研究基因组里每个基因的具体功能成为所有生命科学研究者要面对的课题。为此,人们将基因组学进一步分为结构基因组学和功能基因组学。前者旨在阐明基于核酸序列的氨基酸序列决定的蛋白质三维结构,填补核酸序列与蛋白质结构间的逻辑空白。后者则在于阐明基因的功能。

  四、细胞组学的研究方案:

  细胞组学是一种新的研究理念,同时它也是一门基于细胞分析技术的学科,细胞组学的发展有赖于先进分析手段和新的生物技术的发展。概括其研究方案主要包括以下几方面:

  

细胞组学图2


  

细胞组学图3


  1、细胞鉴别:通过细胞分选可以排除异质细胞体系因细胞间的不同对单细胞研究产生的干扰,反映细胞的真实情况。其过程用细胞功能的相关指标进行标记,包括膜上表面抗原、Ca 2+ 以及对核酸物质进行染色,经过流式细胞仪或者光学显微分析可以对细胞的形态包括细胞膜、细胞核、细胞器等进行三维重构,实现细胞的辨别。通过标记可以用于不同类细胞的辨别,也可用于同类细胞在不同活力状态,包括凋亡或者死亡状态的辨别。细胞辨别后,可以通过细胞分选仪实现细胞分离,再进行后续的蛋白质和基因研究;也可以直接在细胞群中进行细胞的研究,通过细胞标记可以获得同类细胞在不同状态下的表型信息,实现在复杂细胞系统如神经系统中以及在组织水平上的细胞组学分析。

  2、细胞分析:单细胞分析可以对同类细胞在不同状态下包括正常和疾病,以及疾病状态和给药后进行分析,从而得到特异的表型差异(组)作为医学研究的判定指标。细胞分析是细胞组学研究的核心,细胞可同时标记上一系列相关的抗体和分子探针,再通过多参数的流式细胞仪或荧光显微镜进行分析,得到一系列差异的图谱。新型的显微分析技术,更多抗体包括专为细胞组学的分子标记的出现,以及多色荧光标记技术的发展使细胞的分析所用的参数越来越多,细胞结构和功能的研究也更为精细。

  3、数据的处理:由细胞分析获得的谱图经过数据转化、筛选、分类、标准化处理,成为生物医学研究可利用和共享的数据。数据的处理,是细胞组学重要的一环,在概念中明确指出,细胞组学要获得细胞的尽可能多的信息,数据的处理便是将这些信息进行抽提,获得与医药研究最相关、最有用的数据。数据的处理过程主要采用聚类分析、模式识别、神经网络等方法进行分析,而细胞组学研究中,Classif1的数据筛选方式在疾病预测中有很好的应用,所获得的一系列数据也可以用于药物的开发。

  五、细胞组学的主要技术手段和分析特征:

  细胞组学的本质是采用灵敏、非侵害性、基于荧光技术的方法,对于单个细胞进行集成化分析,以揭示组织和生命体的复杂行为。由于大量荧光标记物和多种仪器专用荧光探针的应用,细胞组学分析已实现了多参数、多色及多元化,能够定性和定量测定,也可以进行终点法和动态连续测量。更重要的是,细胞组学技术能够根据细胞荧光定量数据与细胞组学成像技术对细胞形态进行综合分析。在当前的细胞组学技术中,已建立了流式细胞术、激光捕获显微切割(lasercapture microdissection,LCM)、共聚焦激光扫描显微镜(confocallaser scanning microscopy,CLSM)、激光扫描细胞分析术(laserscanning cytometry,LSC)以及高内涵筛选(highcontent screening, HCS)和生物成像等相关技术。其中 HCS 由于可以同时提供高内涵和高通量分析,也被用于药物发现和毒理学检测。

  1、流式细胞术:

  该方法要求细胞(或生物学微粒)为悬浮状态。FCM可以对同一细胞的多种荧光标记物进行发射光的定量,并且发射光与其形态相关,能够揭示关键细胞的功能和结构。分析速度可以达到每秒上千个细胞,并根据异质细胞群中的单个细胞的荧光或发射光特性将其分开。FCM 具有多参数特征,并可进行终点法或动态测定,能够在选定的细胞群中定量分析药物作用引起的细胞效应,提供多种靶标,为细胞敏感性或抗药性提供直接证据。

  

细胞组学设备图


  2、激光捕获显微切割:

  为了改进细胞分离手段,在固体组织中实现细胞分离纯化,人们发展了多种显微切割方法。LCM技术以自动化及标准化的显微切割能力,增加了从复杂组织中选择目标细胞来进行后续分子分析的重复性和准确性。它由倒置显微镜配合一个小功率的近红外激光器组成。激光可精确地将单个细胞或一团细胞选出用于分析。这样就可以比较异质性、检测突变,并比较同一组织中多种细胞类型的基因表达。

  3、共聚焦荧光扫描显微镜:

  CLSM 检测法优于传统的荧光显微镜,因为它排除了对焦不准造成的模糊,并且可以在较厚标本中产生连续的光学叠加。共聚焦可以应用于标记了适宜荧光探针的固定或活的样品。在某些特定高内涵分析实验中需要进行共聚焦,特别是那些要求对细胞器或细胞膜进行精确辨别定位的实验。在异质细胞群中,有些细胞可能由于有丝分裂或凋亡而变圆,偏离大多数细胞的聚焦平面,且在分析中被遗漏,而共聚焦则可以对完整样本进行采集。由于这项技术可以根据空间和时间进行荧光测定进而得到完备的细胞信息,因而越来越多地被用于科学和技术领域。

  4、激光扫描细胞分析术:

  LSC 是一种基于显微镜的扫描荧光计,结合了流式细胞术和细胞成像术的优点。它可以通过直接测定固定样品中单个细胞的荧光来进行多参数分析,如在多种载体包括玻片、培养皿和多孔板上的单层细胞、涂片、印记、离心细胞或组织块。此外,它可以对目标细胞进行再着色和坐标的重新定位分析。最后通过荧光测定单细胞的结果可以用直方图或散点图表示,并用单细胞照片或照片图表结合表示,从而进一步分析。

  5、高内涵筛选生物成像:

  典型的 HCS 生物成像系统是由自动荧光显微镜,捕获图像的电荷耦合器件图像传感器(chargecoupled device,CCD)照相机和一个图像存储及数据处理系统组成的。图像获取和分析的每一步骤都是由软件控制的。当 HCS 生物成像系统应用于细胞水平的高通量筛选时,这项创新技术允许使用多孔板并在每次实验中对大量细胞进行分析。由于HCS 成像仪具有滤镜和分光镜体系,可以收集多种荧光波长,因而可同时产生多个细胞指标,包括每种荧光标记细胞组分(如 DNA 和蛋白质)的荧光强度和定位,还可测量其数目、大小和形状。该系统的速度可以达到每秒检测一个孔并使瞬时性和空间分辨率相结合。此外,它具有保持稳定温度和CO2条件的能力,可以进行活细胞功能实验。图像水平的高内涵实验与其他技术相比,具有多种优势。首先,它可以对贴壁细胞进行分析,保留了所有的形态特征和目的靶标分析;更重要的是,固定细胞可以进一步用其他探针试剂或抗体进行检测,其存档的图像可以利用不同的分析方法处理,因而可以从同一样本中提取出更多的附加信息。另一个重要优势是可以用较少的细胞得到更有力的数据结果,如可以在高密度孔板上以最小化的载体(384 或 1536 孔板)进行实验,提高了通量,同时节约了时间和试剂。

  六、细胞组学在新药研发中的应用:

  多参数和重复测定,尽可能多地获取数据,是观察药物作用的分子机制、预测药物有效性和毒性的重要依据。细胞组学技术为新药筛选与优化提供了有效的手段和研究策略,广泛应用在新药研究的各个阶段。

  1、在药物作用靶标确证中的应用:

  目前,超过40%的开发中的化合物是针对全新的作用机制;将近 70% 的药物靶标都处于探索阶段。在新药早期研究中,对作用机制全新的药物研究比靶标确定的新药风险更高,因而,靶标的确证极为重要。由于功能性药物靶标的研发需要适当的细胞内环境,而细胞内蛋白的功能取决于其生理过程和环境,因此,分析健康和疾病状态下细胞类型及其结构和功能上的差异,确定疾病状态的一系列表型,是识别和确定潜在药物作用靶标的有效途径。细胞周期对于抗癌药物来说是一个良好的靶标,因而在细胞学和药物开发中研究得比较透彻。识别一些看似合理的药物靶标,诸如细胞周期蛋白依赖激酶(cyclindependent kinase,CDK),促进了特异性抑制剂的开发。但是,运用细胞组学手段分析细胞表型特征后发现,遗传修饰小鼠缺乏细胞周期蛋白和CDK,这推翻了之前许多相关假设,证明几乎所有细胞类型中的大部分 G1 细胞周期蛋白和CDK 是不必要的。除此之外,不同疾病初始过程细胞类型的确定尤为重要,因为不同细胞类型随时间和空间不同,表现出不同的结构和功能,而疾病初始过程中细胞的类型往往提供了疾病发展的源信息。因而利用细胞组学技术确定合适的细胞类型,必将为新靶标的寻找和研究提供便利。

  2、在体外药理毒理学评价中的作用:

  药理学与毒理学作用特征是新药能否成功的重要依据。在筛选和评价新药时,可利用细胞组学的分析策略来研究药物干预细胞的作用。细胞组学应用于药理毒理学研究,不仅可以提供可靠的细胞模型,还可以提供新药作用细胞的各种效应信息,包括靶标表达、靶标介导的细胞应答、各种信号转导途径、药物代谢、细胞死亡或增殖等。

  (1)、鉴定及选择特定细胞作为最佳研究模型:

  借助于表面标记物的荧光、细胞内的功能性活动、形态特征或几方面结合起来,细胞组学实验可以从一个复杂的细胞组中鉴定并最终纯化出一个特定的细胞亚群。高内涵显微检验法可以通过形态学和关键蛋白的表达来选择适宜的待测细胞群,并可通过标准化的阈值设定来排除异常细胞,增加细胞的均一性。近来研究表明,当检测细胞多个表型指标时,如果阳性样本过少或在进行探索性表型分析,可以应用反馈式细胞分选方法,即用户可自定义具有特殊表型的阳性样本细胞及不具有此表型的阴性样本细胞,此时可利用“机械学习算法” 作为暂行分类依据对细胞群进行分类,其后研究者可根据可视的细胞分类情况修正算法错误,并重新分类,如此反复几次,便可对人们感兴趣的表型制定特殊的分类依据,从而将细胞分类大大精确化。

  (2)、鉴定细胞对药物的敏感性:

  来源不同的组织和细胞系对药物具有不同的敏感性。在不同浓度下对化合物的多种毒性指标进行平行测定对于敏感性和毒性预测来说是非常必要的。最近一项关于小分子表型谱的研究将化合物取了 13 个不同的浓度,确证了药物的最低有效浓度,并证明了可以在细胞表型水平对其专一性进行有效确定。细胞组学可以鉴定靶标分子的表达状况以及给药条件下是否存在功能靶标。通过对外源分子的摄入、保留、生物转化以及排出相关参数,判断特定细胞的敏感性,揭示整个细胞组或特定细胞亚群在给药时所产生的效果,为细胞对外源分子的敏感性或耐受性提供证据。近来,细胞组学实验也用于检测经过基因组改造的真核或原核细胞的敏感性,使细胞组学成为寻找体外细胞毒性检测新模型的好方法。

  (3)、监测和定量分析药物毒性:

  在众多生理学、生物化学和药理学实验中,必须评估潜在化疗药物的遗传毒性,以排除其致突变和致癌性。细胞组学技术广泛用于细胞和器官毒性的定量和定性分析。如高内涵分析可以针对单细胞形态、细胞周期分布/增殖、凋亡以及其他参数,提供有效鉴定化合物毒性的方法。药物发展中的一个关键参数,就是测定药物发挥其药理学作用但还未产生毒性的作用浓度。细胞组学的多参数功能能够为评估特定细胞亚群的非致死损害或死亡提供多种标记和分界点。因此,细胞组学临界点可能是早期或晚期细胞毒发生的标志参数。在毒性检测方面,荧光显微镜通过测量染色体异常和 DNA 损伤很好地揭示了化合物对哺乳动物的毒性。微核实验可以评价遗传毒性的很多方面,如当暴露于 UV 辐射后碱基和核苷酸的切除修复率、肿瘤放射敏感性等。很多实验现在不仅仅以核酸来评价毒性,还通过钙平衡、线粒体膜电位和细胞膜通透性来评价毒性。最近有报道利用荧光显微镜评价阳离子化合物特定的毒性作用,如磷脂等。通过检测溶酶体中标记磷脂的荧光积累,同时对核进行染色,以与普通的细胞毒性相区分。

  (4)、阐明药物作用机制:

  细胞组学策略经常被用于探索人类、动物和微生物细胞模型与药物和毒物的作用机制。这主要依赖于系统的细胞分析,有助于揭示药物干预细胞后其形态、功能变化(如分化、细胞死亡、生长和细胞增殖)内在的信号通路及分子的变化特征。这种对于细胞内分子网络的定量分析,有助于了解疾病细胞在自然状态下信号通路功能障碍,综合分析药物的调节途径和作用位点。例如,p53 作为肿瘤抑制因子一直受到人们的关注,Hdm2 通过调节 p53 转录活性和稳定性来抑制其功能,因此抑制 p53 与Hdm2 的相互作用来激活肿瘤细胞中的 p53 成为肿瘤药物发现中的焦点之一。采用绿色荧光蛋白辅助发现蛋白相互作用的技术通过高内涵成像实验可以来检测 Hdm2 与p53 的相互作用。因而有利于靶标确定化合物的筛选和作用机制的研究。除此之外,细胞组学中的高内涵分析不局限于已有的信号通路相互联系,可避免遗漏一些有价值的基本信息,能更全面地揭示药物作用机制的本质。如可通过高内涵蛋白片段互补实验,构建突变的荧光蛋白片段检测化合物的隐藏效应。当药物激活或抑制特定信号通路后,可以检测蛋白复合物的时空间变化。通过检测大量不同蛋白复合物反应,就可得到大量关于药物作用信号通路的信息。

  3、应用于临床药效预测和个性化用药:

  除应用于新药临床前研究外,细胞组学还可应用于新药的临床开发阶段,以更好地预测药效及指导患者的个性化用药。多参数 FCM 对于特定的需要个性化治疗的患者相当重要。它可对患者肿瘤细胞进行特定分析,预测药物作用后产生应答反应的可能性,尽量避免药物的过度使用。在肿瘤治疗中,多参数技术手段可以揭示细胞蛋白作用途径,这对于确定最佳治疗方案以提高患者的生存率和生存质量都有重要作用。